多細胞生物的每個細胞都攜帶著相同的遺傳學信息。不過，近年來蓬勃發(fā)展的單細胞研究告訴我們，每一個細胞都是獨一無二的。The Scientist雜志近聯(lián)系了單細胞研究領域的一些專家，請他們分享了在單細胞中進行轉錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構建文庫，處理和分析結果數(shù)據(jù)。
那么，細胞之間的哪些差異有生物學意義，哪些差異來自于技術偏好呢?要獲得可靠的結果又需要研究多少細胞呢?這些問題曾經是單細胞研究(尤其是單細胞轉錄組研究)的攔路虎，令人望而卻步。單細胞RNA測序(scRNA-seq)和單細胞數(shù)據(jù)分析工具在這方面為人們提供了很大的幫助。
The Scientist雜志近聯(lián)系了單細胞研究領域的一些專家，請他們分享了在單細胞中進行轉錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構建文庫，處理和分析結果數(shù)據(jù)。
測序方法大比拼
在單細胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，很少有人對這些方法進行系統(tǒng)的比對。慕尼黑大學生物學家Wolfgang Enard近領導團隊，在小鼠胚胎干細胞的基因表達研究中比較了一些常用的單細胞測序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
Smart-seq
SMART(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)是一個具有里程碑意義的重要技術。實際上，能夠從單細胞生成全長cDNA的測序方案并不多，Smartseq就是其中之一。對于等位基因特異性表達或者剪接變體研究來說，覆蓋整個轉錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細胞制備系統(tǒng)能夠自動完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細胞懸液加進去，儀器就會分離并裂解細胞，把mRNA逆轉錄為cDNA，再對cDNA進行擴增。擴增后的cDNA可以拿來測序，也可以進行qPCR檢測。
在Enard的比較研究中，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seq為靈敏，成本也高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復使用，不過這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實健康單細胞的存在。
斯坦福大學的學者Stephen Quake及其團隊利用Fluidigm C1單細胞制備系統(tǒng)，對人類大腦皮層的482個單細胞進行了高通量轉錄組測序，終得到了466個單細胞的RNA測序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析表明，單細胞測序結果不但能用于區(qū)分神經元、神經膠質細胞以及血管細胞，還能將神經元分為五類興奮性細胞和兩類抑制性細胞。
CEL-seq
CEL-seq(Cell expression by linear amplification and sequencing)是一種采用線性擴增的常用測序方法。線性擴增的主要優(yōu)勢是錯誤率比較低，不過線性擴增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術發(fā)表于2012年，主要是分離單細胞，逆轉錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細胞來源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴增方法生成文庫花費的時間要稍微長一點。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進行混合，大大減少了手動操作的時間。PCR是在后階段使用的，主要是為了連接正確的測序接頭，CEL-seq開發(fā)者紐約大學的Itai Yanai介紹到。
CEL-seq所需試劑都是現(xiàn)成的，大約兩天時間生成測序文庫和測序數(shù)據(jù)，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq與大多數(shù)方案一樣，測序轉錄本的3’ 端。Enard等人并沒有親自嘗試著一技術，只是在比較研究中用到了CEL-seq數(shù)據(jù)。從這項研究來看，CEL-seq的重現(xiàn)性好。GitHub網站提供有CEL-seq可用的生物信息學工具。Yanai研究團隊正在開發(fā)新版本CELseq2，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。
SCRB-seq
Broad研究所開發(fā)的SCRB-seq(single-cell RNA barcoding and sequencing)技術采用的是PCR擴增。該技術需要結合流式細胞儀(FACS)或者其他細胞分選方法，把單細胞分配到微孔里去。
SCRB-seq與Smart-seq比較相似，只不過SCRB-seq會整合特異性的細胞條碼，以分辨擴增分子的來源，更準確的定量轉錄本。此外，SCRB-seq并不生成全長cDNA，而是像CELseq一樣富集RNA3’端。
2014年，開發(fā)者們將SCRB-seq技術提前發(fā)布在BioRXiv上。隨后他們對這一技術進行了更新，并將其更名為“high-throughput eukaryote 3’ digital gene expression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技術服務，SCRB-seq也被整合到了WaferGen Biosystems公司的scRNA-seq平臺上。
據(jù)說Fluidigm公司的C1系統(tǒng)很快也將支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard中意的測序方法，它不僅適用于單細胞RNA測序，還能支持大量細胞(bulk)的RNA測序?？上У氖荢CRB-seq并不好DIY，研究者自己很難將測序流程與FACS對接起來。
目前，在單細胞中揭示DNA甲基化與基因表達的直接關聯(lián)還比較困難。這是因為細胞之間存在較大的差異，又不能同時檢測一個細胞的轉錄組和甲基化組。加州大學范國平教授和同濟大學薛志剛教授在5月5日的Genome Biology雜志上發(fā)布了自己開發(fā)的新單細胞測序方法——scMT-seq。這種方法能夠同時分析單個細胞的轉錄組和甲基化組。
