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RNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用
行業(yè)新聞 2018-11-13
　　細(xì)胞作為生命結(jié)構(gòu)的基本單位，儲(chǔ)存大量的生物信息。細(xì)胞異質(zhì)性是生物組織的普遍特征，即使是相同類(lèi)型的細(xì)胞受到周?chē)h(huán)境的影響也會(huì)存在基因表達(dá)的差異。細(xì)胞的發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，處于不同階段的同一細(xì)胞基因表達(dá)不同。以往的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(bulk RNA-sequencing，bulk RNA-seq)[3]需要對(duì)成千乃至上百萬(wàn)的細(xì)胞大樣本進(jìn)行分析，是對(duì)大量細(xì)胞測(cè)序分析得出的平均結(jié)果，或者反映的是數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞數(shù)據(jù)，這就會(huì)掩蓋部分重要信息，忽略細(xì)胞之間或細(xì)胞亞型之間的異質(zhì)性，不利于生物多樣性的理解和研究。而對(duì)于干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞這類(lèi)稀有細(xì)胞則因樣本量較少，無(wú)法作出準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析。為了解單細(xì)胞異質(zhì)性，近年來(lái)興起的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(single-cell RNA-sequencing，sc RNA-seq)備受關(guān)注。

　　sc RNA-seq是從單個(gè)細(xì)胞水平獲得全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜，其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序。2009年，Tang等[4]首次將該技術(shù)應(yīng)用于單個(gè)小鼠的卵裂球的基因分析中，最終發(fā)現(xiàn)了芯片未檢測(cè)到的5200多個(gè)基因和1800個(gè)可變剪切點(diǎn)。單細(xì)胞測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建流程主要包括單細(xì)胞提取、細(xì)胞裂解、mRNA 反轉(zhuǎn)錄、cDNA 擴(kuò)增及文庫(kù)構(gòu)建等。本文將對(duì)sc RNA-seq過(guò)程中的幾項(xiàng)基本技術(shù)特征進(jìn)行分析，并闡述該技術(shù)在眼科研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。1sc RNA-seq的基本技術(shù)特征

   1.1單細(xì)胞分離技術(shù)　

       目前，常用的單細(xì)胞分離技術(shù)主要包括顯微操作(micromanipulation)、激光捕獲顯微切割(laser-capture microdissection，LCM)、熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)和微流控技術(shù)(microfluidics)等。因各項(xiàng)技術(shù)的靈敏度和產(chǎn)出率不同，應(yīng)用范圍亦有所不同。顯微操作技術(shù)和LCM是依賴(lài)人工在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和顏色特征來(lái)挑取單個(gè)細(xì)胞的方法，常用于從培養(yǎng)的細(xì)胞系、早期的胚胎細(xì)胞和固定組織切片中提取單個(gè)細(xì)胞。這兩種方法要求操作者技術(shù)熟練，難度較大，耗時(shí)較長(zhǎng)，產(chǎn)出率較低。FACS有20種不同的參數(shù)設(shè)置，可依據(jù)細(xì)胞大小和形態(tài)，或預(yù)先用熒光標(biāo)記的抗體識(shí)別細(xì)胞表面標(biāo)記物，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選出目的細(xì)胞。FACS具有全自動(dòng)和高通量的特點(diǎn)，但是該項(xiàng)技術(shù)需要細(xì)胞初始樣本量較大，對(duì)于一些稀有細(xì)胞群體并不適用。微流控技術(shù)是在微米級(jí)通道中分離、捕獲單個(gè)細(xì)胞，可以用于稀有細(xì)胞的篩選，該方法反應(yīng)體系小、樣本需求量小、節(jié)約試劑、減少污染，因此，微流控技術(shù)被認(rèn)為是目前單細(xì)胞分離最好方法。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用講解_RNA-seq

　　1.2　單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增及測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建　

       單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增是sc RNA-seq的關(guān)鍵步驟。根據(jù)合成第二條cDNA 鏈時(shí)使用的酶，可將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的cDNA 擴(kuò)增方法分為PCR 法(如mRNA-Seq、Smart-Seq、Smart-Seq2、STRT-Seq和SMA)、體外轉(zhuǎn)錄法(如CEL-Seq) 和Phi29 聚合酶法(如PMA)。近年來(lái)，芯片液滴法作為新一代的文庫(kù)構(gòu)建方法，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

　　Islam等[11]發(fā)明的CytoSeq技術(shù)是將細(xì)胞懸液加入微反應(yīng)孔中進(jìn)行基因分析，用于研究細(xì)胞表達(dá)的差異，檢測(cè)罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型，該方法不受細(xì)胞體積的限制，可直接對(duì)不同大小和性狀的混合細(xì)胞群進(jìn)行研究。但該技術(shù)目前只能用于已知基因的研究，不能發(fā)現(xiàn)新基因。Drop-Seq[12]和inDrops[13]是將細(xì)胞懸液封裝在含有DNA啟動(dòng)子條形碼的水凝膠球的液滴中，然后細(xì)胞溶解，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，mRNA被條形碼標(biāo)記?？勺粉櫭總€(gè)基因的細(xì)胞來(lái)源，顯著提高了測(cè)序通量并降低了測(cè)序成本。液滴微流控平臺(tái)可同時(shí)捕獲上千個(gè)單細(xì)胞，并對(duì)其轉(zhuǎn)錄組或基因組進(jìn)行測(cè)序，具有反應(yīng)試劑少、效率高等特點(diǎn)。目前，許多平臺(tái)已經(jīng)商業(yè)化，并向研究人員提供單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。Illumina是一個(gè)大量平行短序列測(cè)序平臺(tái)[14]，可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，細(xì)胞通量大，測(cè)序效率高，但儀器設(shè)備昂貴。

        ChromiumTM Single Cell 3′Solution平臺(tái)是10x Genomics公司研發(fā)的一種直接的、低成本的測(cè)序方法，一次可封裝8個(gè)樣本，耗時(shí)約6 min，細(xì)胞捕獲效率近50%。利用一種新的簡(jiǎn)易算法“Supernova”，每次計(jì)算僅需2 d時(shí)間，大大提升了檢測(cè)效率。目前已廣泛應(yīng)用于臨床多個(gè)領(lǐng)域。ICELL8(WaferGen Biosystems)是一種新的單細(xì)胞RNA測(cè)序系統(tǒng)，芯片含有5184個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔均填充有寡核苷酸編碼的poly-d(T)、獨(dú)特的條碼和單一分子識(shí)別符，可捕獲約1300個(gè)單個(gè)細(xì)胞。

         該系統(tǒng)具有一個(gè)多樣本納米級(jí)分配器 Multi-Sample Nano-Dispenser (MSND)，與顯微鏡連接，可在數(shù)分鐘內(nèi)對(duì)所有的反應(yīng)孔進(jìn)行觀察，大約可以有37%的反應(yīng)孔捕獲單個(gè)細(xì)胞，MSND可以?xún)H向含有單個(gè)細(xì)胞的反應(yīng)孔中填加反應(yīng)物，很大程度上節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用。該系統(tǒng)可以從復(fù)雜樣本中分離單個(gè)細(xì)胞，是一個(gè)高效經(jīng)濟(jì)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，能夠完成上千個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜分析，使得研究人員能夠?qū)?fù)雜的生物樣本細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行破譯，具有細(xì)胞重復(fù)率低、交叉污染少、純度高等特點(diǎn)。Fluidigm公司研發(fā)的C1 單細(xì)胞擴(kuò)增儀器[21]，可以在同一芯片上自動(dòng)完成Smart-seq步驟，將單細(xì)胞分離、反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，即可進(jìn)行二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)或qPCR，顯著提高了測(cè)序效率，省時(shí)省力。但是這些方法需要特殊儀器，耗資巨大。

         而改良的Smart-seq2方法，可以同時(shí)對(duì)上百個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，不需要試劑盒或特殊的單細(xì)胞捕獲工具。Gardeux的研究團(tuán)隊(duì)等開(kāi)發(fā)了一個(gè)針對(duì)sc RNA-seq數(shù)據(jù)的完整分析的網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，即自動(dòng)化單細(xì)胞分析途徑(automated single-cell analysis pipeline，ASAP)，運(yùn)用這一平臺(tái)，科研人員不需要具備強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)技術(shù)和知識(shí)儲(chǔ)備，僅使用各種常用的算法和工具來(lái)分析sc RNA-seq的數(shù)據(jù)。這為人們分析細(xì)胞多樣性和異質(zhì)性提供了有效的工具。Hu等在論文中描述了一種新的方法，即用機(jī)器學(xué)習(xí)算法[如support vector machine (SVM) 和random forest (RF)]分析sc RNA-seq數(shù)據(jù)。這是一種鑒別不同細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異的最佳方法，還可以擴(kuò)展并適用于其他單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)譜的研究，如高度異質(zhì)性腫瘤的進(jìn)展和治療。許多生物信息學(xué)工具是專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)分析，在干細(xì)胞領(lǐng)域被用來(lái)區(qū)分細(xì)胞類(lèi)型及細(xì)胞亞型，確定標(biāo)記基因。Monocle是最近發(fā)明的一種針對(duì)sc RNA-seq數(shù)據(jù)的無(wú)監(jiān)督算法，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)空間降維形成一個(gè)偽時(shí)間軌跡，對(duì)細(xì)胞發(fā)育和分化的進(jìn)程進(jìn)行時(shí)間序列重構(gòu)。這種序列重排揭示了關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)的閘門(mén)式變化，發(fā)現(xiàn)新型的細(xì)胞分化的調(diào)控因子。這項(xiàng)研究表明，用Monocle進(jìn)行單細(xì)胞表達(dá)分析，揭示監(jiān)管分化的新調(diào)控作用。


RNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用
　　1.3　sc RNA-seq的應(yīng)用　細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，因細(xì)胞狀態(tài)、環(huán)境刺激因素和內(nèi)在程序的不同，轉(zhuǎn)錄組信息的變化呈多樣性表現(xiàn)，這種多樣性是構(gòu)成細(xì)胞異質(zhì)性的關(guān)鍵因素。

        sc RNA-seq能夠從單個(gè)細(xì)胞水平研究RNA的差異表達(dá)。自2009年，Tang等首次應(yīng)用sc RNA-seq以來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)已發(fā)展成為研究復(fù)雜生物體系細(xì)胞異質(zhì)性的有效方法，被更多的研究人員應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，包括干細(xì)胞發(fā)育和分化、胚胎期器官的發(fā)育、腫瘤、免疫、神經(jīng)以及微生物等。
        下面將對(duì)近年來(lái)該技術(shù)在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

       2sc RNA-seq在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用

       2.1sc RNA-seq在眼部細(xì)胞亞型及罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型鑒定中的應(yīng)用　

       神經(jīng)系統(tǒng)是由多種細(xì)胞組成，僅與視覺(jué)相關(guān)的成年小鼠大腦視皮層就含有上百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。精確的細(xì)胞分類(lèi)有助于科學(xué)家對(duì)大腦的發(fā)育、功能以及疾病狀態(tài)等方面進(jìn)行研究。近年來(lái)，根據(jù)sc RNA-seq在大腦皮層、下丘腦以及感覺(jué)神經(jīng)元等方面研究的應(yīng)用，將細(xì)胞按基因表達(dá)特征進(jìn)行分類(lèi)，使人們對(duì)神經(jīng)多樣性的理解更加深入。

        視網(wǎng)膜屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，含有60余種神經(jīng)元，在視覺(jué)圖像產(chǎn)生過(guò)程中起特定的作用。視覺(jué)圖像的產(chǎn)生包括3個(gè)階段，首先平行光線被光感受器細(xì)胞捕獲，將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，然后經(jīng)雙極細(xì)胞傳導(dǎo)至特定的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形成神經(jīng)沖動(dòng)，最后經(jīng)視神經(jīng)傳入大腦視覺(jué)中樞。視網(wǎng)膜是一種易于觀察、易于獲取的組織，又具有一定的神經(jīng)元多樣性，是研究細(xì)胞發(fā)育、神經(jīng)元分化以及神經(jīng)系統(tǒng)多樣性的完美模型，它由多種細(xì)胞類(lèi)型組成，包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、雙極細(xì)胞、光感受器細(xì)胞以及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等。對(duì)于如此復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，應(yīng)用傳統(tǒng)的大量細(xì)胞基因測(cè)序(bulk RNA-seq)，將不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞之間的特異性。而sc RNA-seq則能夠精確反映單個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞的基因表達(dá)情況。

         Goetz等在JoVE中闡述了單個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析的實(shí)驗(yàn)步驟。Laboissonniere等應(yīng)用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亞型進(jìn)行分類(lèi)，目的是將細(xì)胞的基因表達(dá)特征與其功能和形態(tài)學(xué)特征聯(lián)系起來(lái)。為確保這種分類(lèi)方法分離出的細(xì)胞亞型具有相同的功能，他們提出在細(xì)胞分離和測(cè)序之前先確認(rèn)它的形態(tài)和功能，使得細(xì)胞亞型標(biāo)記物的識(shí)別更容易，分類(lèi)更準(zhǔn)確。Shekhar等用GFP轉(zhuǎn)染雙極細(xì)胞和Müller膠質(zhì)細(xì)胞，F(xiàn)ACS收集GFP陽(yáng)性細(xì)胞，應(yīng)用大規(guī)模平行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(Drop-seq)對(duì)約25 000個(gè)小鼠視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，獲得了15個(gè)細(xì)胞亞型。同時(shí)利用分子表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)相匹配的方法驗(yàn)證了這種分類(lèi)方法的準(zhǔn)確性，并鑒定了數(shù)十種新的遺傳標(biāo)記物。單個(gè)視網(wǎng)膜亞型細(xì)胞遺傳標(biāo)記物的鑒定，有助于研究和繪制與特定視功能相關(guān)的靶點(diǎn)，使人們更深入地了解細(xì)胞功能及細(xì)胞異質(zhì)性的來(lái)源，探究維持細(xì)胞多樣性的基因網(wǎng)絡(luò)。

　　另外，sc RNA-seq可用于罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型的鑒別，如干細(xì)胞、前體細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞等，以利于深入理解這些稀有細(xì)胞種群的生物學(xué)功能和特征。Kameishi等[40]發(fā)現(xiàn)兔角膜緣上皮旁群細(xì)胞與非旁群細(xì)胞相比具有干細(xì)胞樣表型，應(yīng)用GO(gene ontology)分析和RNA測(cè)序表明角膜緣上皮旁群細(xì)胞的間充質(zhì)/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)較上皮細(xì)胞標(biāo)記物顯著增強(qiáng)，另外，單細(xì)胞qRT-PCR顯示角膜緣上皮旁群細(xì)胞至少含有2種未成熟的細(xì)胞群，具有內(nèi)皮樣或間充質(zhì)樣表型，提示在角膜緣存在一種新型的角膜上皮干細(xì)胞，與傳統(tǒng)的角膜上皮干細(xì)胞不同。目前，角膜緣上皮旁群細(xì)胞的研究促進(jìn)了角膜上皮再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)展，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析不僅僅鑒定了新的角膜上皮干細(xì)胞，同時(shí)也可以更好地理解干細(xì)胞或前體細(xì)胞在體內(nèi)組織損傷修復(fù)過(guò)程中的作用。

　　2.2　sc RNA-seq對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)病機(jī)制及治療的研究　視網(wǎng)膜退行性病變，如視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)，以光感受器細(xì)胞進(jìn)行性損傷為特征，是發(fā)達(dá)國(guó)家視力喪失的主要原因[41]。先前關(guān)于AMD的遺傳學(xué)研究認(rèn)為可能的危險(xiǎn)因素包括基因遺傳、紫外線暴露、飲食習(xí)慣、心血管疾病、吸煙、飲酒等，其中基因遺傳因素起非常重要的作用[42]。隨著sc RNA-seq等基因組技術(shù)的研究進(jìn)展，科學(xué)家將基因與發(fā)病機(jī)制相聯(lián)系，進(jìn)一步明確該疾病的發(fā)病機(jī)制。

RNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用
 
       Radeke的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)68例捐獻(xiàn)的眼組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基因比較，其中包括31例正常眼，26例已確診為AMD，11例被認(rèn)為具有發(fā)展成為AMD的高危因素。研究發(fā)現(xiàn)50余個(gè)基因在AMD 細(xì)胞中高表達(dá)，其中前20個(gè)基因能夠?qū)MD的診斷進(jìn)行預(yù)測(cè)。在對(duì)RPE/脈絡(luò)膜層的轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)中，他們發(fā)現(xiàn)與凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在干性AMD患者中呈高表達(dá)，而與血管生成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在濕性AMD患者中呈高表達(dá)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是所有類(lèi)型AMD的核心特征，由此推斷AMD可能是一類(lèi)具有共同的免疫反應(yīng)過(guò)程的單一疾病。根據(jù)這些結(jié)果，針對(duì)核心免疫過(guò)程的藥物可能成為AMD治療的靶向藥物。Morgan 等應(yīng)用基因組技術(shù)比較了健康者和AMD患者的外周血及眼組織中基因表達(dá)和信號(hào)通路的不同，確定了特定危險(xiǎn)基因與該疾病的關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)特異性的靶點(diǎn)治療提供科學(xué)依據(jù)。

　　2.3　sc RNA-seq對(duì)干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變后基因單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序變化的評(píng)估　視網(wǎng)膜退行性病變尚無(wú)有效的治療方法，干細(xì)胞或前體細(xì)胞移植是目前實(shí)驗(yàn)研究中最具潛能的治療方法，可能終止或延緩視力喪失的進(jìn)程。隨著干細(xì)胞移植在視網(wǎng)膜退行性病變治療方面研究的不斷進(jìn)展，其基因表達(dá)變化的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。
               Jones 等將人腦源性神經(jīng)前體細(xì)胞(human neural progenitor cells，hNPC)移植到RCS (royal college of surgeons)視網(wǎng)膜退行性病變大鼠視網(wǎng)膜下，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的視網(wǎng)膜中RNA數(shù)據(jù)，與假手術(shù)組RCS大鼠和 LE (long evans)大鼠對(duì)照。分析得出RCSsham 與LEsham有1215個(gè)基因差異性表達(dá)，RCShNPCs與 RCSsham 有283個(gè)基因差異性表達(dá)，比較這2組基因，發(fā)現(xiàn)68個(gè)逆表達(dá)基因(稱(chēng)為救援基因)，包括Pdc、Rp1和 Cdc42ep5。該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究結(jié)果為研究hNPC移植治療視網(wǎng)膜退行性病變后的基因表達(dá)變化提供依據(jù)。在將來(lái)的干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變的研究中，sc RNA-seq可用于增強(qiáng)或預(yù)測(cè)治療的反應(yīng)。

　　2.4　sc RNA-seq在眼部腫瘤的靶向治療研究中的應(yīng)用。
        眾所周知，腫瘤的分子特征和細(xì)胞特征可提示腫瘤細(xì)胞的來(lái)源，為靶向治療提供依據(jù)。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種嬰幼兒常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤。1897年Wintersteiner曾嘗試將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的細(xì)胞特征與特異性的視網(wǎng)膜細(xì)胞類(lèi)型聯(lián)系起來(lái)，認(rèn)為光感受器細(xì)胞可能是腫瘤細(xì)胞的來(lái)源。還有人則認(rèn)為其來(lái)源于前體細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞或無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。關(guān)于腫瘤細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題引起的爭(zhēng)論大約持續(xù)了一個(gè)世紀(jì)。

        如今，Mcevoy等對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者及小鼠模型的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞基因表達(dá)陣列分析，顯示在單一視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的細(xì)胞中存在多種細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)，主要包括光感受器細(xì)胞、視網(wǎng)膜前體細(xì)胞和含有無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞與水平細(xì)胞的中間神經(jīng)元，這種現(xiàn)象在正常視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中是不存在的，說(shuō)明在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，控制視網(wǎng)膜發(fā)育和構(gòu)建不同細(xì)胞類(lèi)型的信號(hào)通路受到干擾。該研究指出從單細(xì)胞水平綜合分析腫瘤的分子、細(xì)胞及生理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和生物合成酶在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中表達(dá)，干擾這些通路可以減少腫瘤在體內(nèi)外的生長(zhǎng)。靶向神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺和吲哚胺受體或下游成分在未來(lái)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究中可能成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤治療的新靶點(diǎn)。

RNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用

　　2.5　sc RNA-seq在眼外傷引起的基因表達(dá)變化中的應(yīng)用　眼球爆炸傷在嚴(yán)重?fù)p壞視功能的同時(shí)還會(huì)發(fā)生基因的改變。Struebing等利用50 psi(1 psi=6.895 kPa)的高壓空氣波致54只小鼠眼球爆炸傷，5 d 后對(duì)視網(wǎng)膜RNA表達(dá)進(jìn)行分析，約40%基因表達(dá)發(fā)生變化。通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法，發(fā)現(xiàn)與天然免疫和獲得性免疫相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)活化，伴隨淋巴細(xì)胞入侵到視網(wǎng)膜內(nèi)層，爆炸損傷還會(huì)引起視功能和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的進(jìn)行性喪失。

       3總結(jié)與展望 隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，sc RNA-seq從技術(shù)和設(shè)備等多方面不斷優(yōu)化，涌現(xiàn)出一系列的商業(yè)化的測(cè)序平臺(tái)，具有單次樣本量大、耗時(shí)短、費(fèi)用低、通量高等特點(diǎn)。sc RNA-seq可以從單個(gè)細(xì)胞的分子水平獲得全基因組的表達(dá)譜，深入了解細(xì)胞個(gè)體間的差異，已廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞的分化、胚胎及器官的發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等多個(gè)研究領(lǐng)域，并取得長(zhǎng)足的進(jìn)步。近年來(lái)，該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用也日漸增多。

        sc RNA-seq可鑒別眼部細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記物，有助于發(fā)現(xiàn)新的罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型及細(xì)胞亞型，深入了解細(xì)胞間的個(gè)體差異。應(yīng)用該技術(shù)分析AMD的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的生物靶點(diǎn)和標(biāo)記物，可能作為視網(wǎng)膜退行性疾病治療的新方法。比較干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變前后的基因表達(dá)變化，可用于增強(qiáng)或預(yù)測(cè)治療的反應(yīng)。通過(guò)該技術(shù)發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)記物，可追溯視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞來(lái)源，闡述腫瘤的發(fā)病機(jī)制，揭示腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，為腫瘤的預(yù)后評(píng)估及個(gè)體化治療提供依據(jù)。sc RNA-seq與生物信息學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合，可為揭示細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供強(qiáng)有力的檢測(cè)方法。
         目前，sc RNA-seq在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用仍較局限，隨著該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，在未來(lái)數(shù)年中可能迅速擴(kuò)展到眼部相關(guān)疾病的研究中，如評(píng)估干細(xì)胞或前體細(xì)胞向眼組織的分化過(guò)程中的基因表達(dá)變化;探索干細(xì)胞眼內(nèi)移植引起免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制;研究各種眼部腫瘤的發(fā)病機(jī)制、個(gè)體化治療和預(yù)后的評(píng)估等。該技術(shù)將逐漸應(yīng)用于臨床，指導(dǎo)疾病診斷及治療。
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